2月17日下午，國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒感染肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制舉行新聞發(fā)布會(huì)，明確了抗瘧疾老藥——磷酸氯喹在治療新冠肺炎臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出的治療效果。這項(xiàng)臨床研究在北京、廣州、湖南等多地的十幾家醫(yī)院聯(lián)合開展。綜合多項(xiàng)治療效果的評(píng)估指標(biāo)，可以確認(rèn)磷酸氯喹對新型冠狀病毒肺炎存在明確的治療效果，且在一百余例用藥患者中尚未發(fā)現(xiàn)和藥物相關(guān)的明確嚴(yán)重不良反應(yīng)。目前，專家組一致推薦“應(yīng)當(dāng)快速將磷酸氯喹納入新一版的診療指南，擴(kuò)大臨床試用范圍?！?/p>
磷酸氯喹作為一款抗瘧疾藥，同時(shí)具有廣譜抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用。與“人民的希望” 瑞德西韋(Remdesivir)不同，它上市時(shí)間已久、無專利限制，在中國有多家藥企具備生產(chǎn)與銷售資質(zhì)，可快速滿足臨床需求；且便于生產(chǎn)和存儲(chǔ)，藥物可及性更高；其毒副作用比洛匹那韋（Lopinavir）、利托那韋（Ritonavir）等抗HIV藥物更小。作為應(yīng)急藥物磷酸氯喹具有多重優(yōu)勢，加之臨床效果明確，成為疫情防控與患者治療“新的希望”。多日來，全國新增病例持續(xù)減少。磷酸氯喹這一治療方法在全國推廣，或?qū)⒓铀傩鹿跔罘窝滓咔楣拯c(diǎn)的到來。
但目前氯喹治療新冠肺炎的機(jī)理和分子機(jī)制尚不清晰。晶泰科技對氯喹可能的作用機(jī)制進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)氯喹可以與催化唾液酸合成的GNE蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象從而影響病毒受體糖基化，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)另一個(gè)氯喹可以穩(wěn)定結(jié)合的潛在靶點(diǎn)PLpro，并將對兩種作用機(jī)制下的有效構(gòu)象進(jìn)行進(jìn)一步的親和力研究。這兩項(xiàng)階段性成果為氯喹治療新型冠狀病毒肺炎的有效性提供佐證，為抗“疫”藥品開發(fā)優(yōu)化提供研究基礎(chǔ)與科學(xué)參考。目前，晶泰科技正與眾生藥業(yè)合作，推進(jìn)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
1月28日，一項(xiàng)由中國科學(xué)院武漢病毒研究院與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物研究所聯(lián)合開展的研究表明，氯喹在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)展現(xiàn)較好抑制作用。2月4日，國家衛(wèi)健委新聞發(fā)布會(huì)發(fā)布，氯喹在初步臨床試驗(yàn)中對新冠肺炎有一定的療效。
這一系列結(jié)果立刻受到各地領(lǐng)導(dǎo)的高度重視。廣東作為人口流動(dòng)大省，疫情防控用藥需求迫切，磷酸氯喹片的復(fù)產(chǎn)工作進(jìn)度也得到省局領(lǐng)導(dǎo)關(guān)注。2月7日，廣東省省長馬興瑞赴佛山、東莞市調(diào)研物資保供穩(wěn)價(jià)工作期間，在東莞市市委書記梁維東、市長肖亞非的陪同下到眾生制藥調(diào)研。馬興瑞省長強(qiáng)調(diào)要加大研發(fā)力度，千方百計(jì)調(diào)用資源穩(wěn)定生產(chǎn)，做好重點(diǎn)藥品供應(yīng)保障工作。2月13日，上海市新冠肺炎疫情防控系列新聞發(fā)布會(huì)中提到，中科院上海藥物所、上藥集團(tuán)聯(lián)合在上海市公共衛(wèi)生臨床中心已聯(lián)合啟動(dòng)羥氯喹的臨床試驗(yàn)。
具備氯喹生產(chǎn)資質(zhì)的廣東眾生藥業(yè)第一時(shí)間完成對磷酸氯喹的小試生產(chǎn)與檢驗(yàn)工作，于2月10日獲得廣東省藥品監(jiān)督管理局下發(fā)的《藥品補(bǔ)充申請批件》，開始批量生產(chǎn)，提供廣東省的藥品儲(chǔ)備，捐贈(zèng)醫(yī)院，以支持當(dāng)?shù)亻_展臨床研究的用藥需求。
同期，晶泰科技與眾生藥業(yè)建立合作，晶泰科技迅速成立氯喹研究攻關(guān)小組，通過分子層面的高精度計(jì)算對氯喹治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的基本機(jī)理、有效結(jié)合模式進(jìn)行研究，迅速推進(jìn)計(jì)算與實(shí)驗(yàn)結(jié)合的驗(yàn)證工作。
氯喹在新型冠狀病毒上的作用機(jī)理
圖1. 氯喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)
氯喹（圖1）以抗瘧疾為主要適應(yīng)癥，近年的研究中發(fā)現(xiàn)它也具有抗病毒的功效。根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道與晶泰科技的研究成果，氯喹治療新冠肺炎COVID-19存在四種可能的機(jī)理：
1. 通過干擾冠狀病毒受體蛋白ACE2（Angiotensin-Converting Enzyme 2 受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）的末端糖基化來削弱病毒與受體的結(jié)合，從而阻斷病毒感染 【1】；
2. 通過提高病毒與細(xì)胞融合所需的內(nèi)吞體的pH值來抑制病毒感染【2】；
3. 通過對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來抑制病毒的復(fù)制【3】；
4. 通過與病毒蛋白水解酶PLpro結(jié)合，抑制冠狀病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而抑制病毒傳播、達(dá)到治療效果。
另有兩種文獻(xiàn)中的氯喹機(jī)理，包括影響ACE2在細(xì)胞表面上的表達(dá)，以及干擾病毒Spike蛋白的合成過程，已在實(shí)驗(yàn)中被排除。
氯喹抑制新型冠狀病毒感染的關(guān)鍵蛋白PLpro
為了綜合考察氯喹抑制SARS-CoV-2的潛在位點(diǎn)， 我們對ChEMBL數(shù)據(jù)庫中與冠狀病毒相關(guān)的小分子抑制劑進(jìn)行了結(jié)構(gòu)相似性搜索，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與氯喹結(jié)構(gòu)相似的分子，其結(jié)合靶點(diǎn)為SARS病毒上的PLpro (PDBID：4OVZ)【4】。病毒編碼的多聚蛋白1a/1ab，通過自身編碼的兩個(gè)蛋白水解酶PLpro（Papain-Like Protease）和3CLpro（3C-like protease）水解產(chǎn)生16個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1～nsp16）。這些非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，是病毒感染宿主過程中的重要功能蛋白。
我們對SARS-CoV-2 PLpro進(jìn)行同源建模，并分別將氯喹的幾種可能的結(jié)合模式和PLpro進(jìn)行對接，并運(yùn)行長程分子動(dòng)力學(xué)模擬評(píng)估復(fù)合物構(gòu)象的穩(wěn)定性。模擬發(fā)現(xiàn)，在較為穩(wěn)定的結(jié)合模式中，氯喹的不同結(jié)合模式在與PLpro結(jié)合的穩(wěn)定性存在差異，其中一種與PLpro結(jié)合更加穩(wěn)定（圖2）。氯喹分子上的喹啉基團(tuán)和Lys157形成了一個(gè)穩(wěn)定的陽離子-π鍵相互作用，同時(shí)緊鄰喹啉環(huán)的氮原子也和Leu162殘基上的羰基形成了一個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，對穩(wěn)定氯喹起到了重要作用（圖2）。
上述模擬結(jié)果表明，SARS-CoV-2 PLpro也可能是氯喹的靶點(diǎn)之一。
圖2 氯喹（綠色）和PLpro（橙色及紫色）的相互作用模式圖
氯喹影響病毒受體糖基化的可能作用機(jī)制
氯喹干擾病毒受體蛋白ACE2的末端糖基化這一機(jī)理推斷，主要源于對SARS病毒（SARS-CoV） 的已有研究。最近的研究結(jié)果表明，SARS-CoV-2在人體中結(jié)合的受體蛋白很可能和SARS-CoV相同，為ACE2蛋白 【5】，并且兩種病毒中負(fù)責(zé)與受體結(jié)合的Spike蛋白（簡稱S蛋白）具有較高的同源性，序列相似度為76.47% 【5】。由此推斷，SARS-CoV病毒S蛋白與受體結(jié)合和細(xì)胞融合相關(guān)的作用機(jī)理可能也同樣適用于SARS-CoV-2的研究。
UDP-N-acetylglucosamine2-epimerase（UDP-GlcNAc 2-epimerase，以下簡稱GNE）在唾液酸（sialic acid）的生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖3），而唾液酸參與SARS-CoV表面受體ACE2的糖基化過程，因此抑制GNE可能會(huì)起到對ACE2去糖基化的作用【6】。
我們對氯喹和GNE蛋白質(zhì)單體的活性位點(diǎn)和別構(gòu)抑制位點(diǎn)進(jìn)行對接，發(fā)現(xiàn)氯喹可以在別構(gòu)位點(diǎn)上形成一個(gè)能量相對穩(wěn)定的對接構(gòu)象，并且和原來晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4ZHT）上的別構(gòu)抑制劑CMP-Neu5Ac的頭部芳香環(huán)形成十分完美的重合（圖4）。
圖3 UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4ZHT）
左上方的小分子為別構(gòu)抑制劑CMP-Neu5Ac
圖4 氯喹（黃色骨架）的對接構(gòu)象
銀色骨架為別構(gòu)抑制劑CMP-Neu5Ac
通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)氯喹的頭部喹啉環(huán)和周圍的蛋白環(huán)境形成了合理的局部作用。喹啉環(huán)上的氮原子和附近的Lys259形成了一個(gè)氫鍵，Lys259和Asp53形成了鹽橋，而Asp53的側(cè)鏈和吡啶環(huán)幾乎平行，又形成了陰離子-π相互作用，環(huán)環(huán)相扣，穩(wěn)定了氯喹喹啉環(huán)的位置。然而，GNE單體上的這個(gè)別構(gòu)位點(diǎn)位于蛋白的表面，這種結(jié)合方式將直接導(dǎo)致氯喹尾部疏水性質(zhì)的碳鏈曝露在溶劑環(huán)境中，并不利于氯喹和GNE的結(jié)合。另一方面，GNE在生物體內(nèi)常常是以二聚體或四聚體的形式起催化作用。別構(gòu)抑制劑在GNE的四聚體結(jié)構(gòu)中成對出現(xiàn) 【7】。因此，基于氯喹在蛋白單體上的對接構(gòu)象，我們建立了GNE二聚體和氯喹復(fù)合物的模型(圖5), 并運(yùn)行20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。經(jīng)模擬優(yōu)化后產(chǎn)生的構(gòu)象顯示，氯喹的頭部喹啉環(huán)依然保持穩(wěn)定，尾部碳鏈則被一些疏水性質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈所圍繞。尾部的季胺氮原子成為氫鍵供體，和受體蛋白主鏈上的氧原子形成氫鍵相互作用（圖5）。
圖5 （a）氯喹（黃色骨架）在GNE二聚體（綠色）上形成的復(fù)合物模型；（b）氯喹經(jīng)動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化后在GNE二聚體別構(gòu)位點(diǎn)上的結(jié)合模式
目前氯喹作用于冠狀病毒的具體機(jī)制還沒有充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬顯示氯喹可以穩(wěn)定結(jié)合于GNE的別構(gòu)位點(diǎn)，因此可能通過抑制UDP-GlcNAc 2-epimerase對唾液酸的合成來影響糖基化，從而發(fā)揮抗SARS-CoV-2病毒的作用；同時(shí)也可以穩(wěn)定地與PLpro結(jié)合，抑制病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，實(shí)現(xiàn)治療效果。
基于以上兩種氯喹抑制SARS-Cov-2的可能機(jī)理，晶泰科技正與眾生藥業(yè)合作，購買實(shí)驗(yàn)蛋白，加速推進(jìn)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，后續(xù)研究成果將持續(xù)與業(yè)界分享，希望能對抗新冠病毒病毒藥物研發(fā)與氯喹進(jìn)一步的臨床研究與應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究參考。感謝我們的合作方眾生藥業(yè)對戰(zhàn)略抗疫情藥物的快速響應(yīng)，也期待臨床試驗(yàn)更多的好消息。
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